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    中国农业科学通报论文模板

    发布日期:2021-01-29 17:27 农业学论文

    基金项目:科技部“十一五”国家科技支撑计划(2006BAK02A21)。基金项目:项目来源“项目名称”(项目编号)。

    第一作者简介:支爱民,男,1976年生于河南新乡,副研究员,博士,研究方向为食品安全检测与营养免疫。地址:河南省郑州市金水区农业路1号,450002,电话,电子邮件:第一作者简介:姓名、性别、出生年份、籍贯、职称、学历、学位、研究方向、学术成就。邮寄地址:具体地址和组织机构邮政编码(能保证你收到编辑部寄给你的发票、期刊等信件的地址),电话:区号-000000,电子邮件:* * * * @ * * * * * * *。

    作者简介:张改萍,男,1960年出生,研究员,博士,中国工程院院士,主要从事动物免疫学和兽药残留研究。电子邮件:通讯作者(如无通讯作者或通讯作者与第一作者相同,不需要此简介):姓名、性别、出生年份、籍贯、职称、学历、学位、研究方向、学术成就。邮寄地址:具体地址和组织机构邮政编码(能保证你收到编辑部寄给你的发票、期刊等信件的地址),电话:区号-000000,电子邮件:* * * * @ * * * * * * *。

    (Tahoma号居中,名字之间用逗号隔开,单个名字的姓和名之间有两个空格。作者单位序号为右上角标准格式,英文相同)

    (1)农业部动物免疫学重点开放实验室,河南省农业科学院,郑州450002;

    (5号在中间,单位序号标在左边。单位所在城市为省会的,不必写出省;如果没有,就必须写出来。如河北保定。英语带)

    摘要:[目的]用CIP人工抗原免疫BALB/c小鼠,建立分泌抗CIP单克隆抗体的杂交瘤细胞系,为免疫学检测方法的建立和具有自主知识产权的检测产品的开发奠定基础。[方法]以EDC法将牛血清白蛋白和卵清蛋白与环丙沙星偶联作为免疫原和包被抗原,用紫外扫描和聚丙烯酰胺凝胶电泳进行鉴定。用合成牛血清白蛋白免疫BALB小鼠。三次免疫后,采用间接酶联免疫吸附试验和封闭酶联免疫吸附试验筛选细胞融合的备用小鼠,选择高滴度和敏感的小鼠进行抗原超免疫,利用杂交瘤技术和脾细胞来源的骨髓瘤细胞建立分泌CIP单克隆抗体的杂交瘤细胞系。体内诱导腹水制备CIP单克隆抗体,并对其效价、敏感性和特异性进行鉴定。[结果]聚丙烯酰胺凝胶电泳显示牛血清白蛋白-环丙肽人工抗原偶联成功;3只免疫小鼠血清抗体效价达到10-4。其中,2号小鼠血清中CIP的抑制效价较高,IC50最低,达到48.59 g/L,融合后筛选出两株敏感特异的杂交瘤细胞Z3G12B3和Z2H8C10。两种细胞的上清液效价为1:512,腹水效价为133602.56 105,Z3G12B3菌株对CIP的IC50为2.47g/l。[结论]获得了一种高效、灵敏、特异的抗CIP单克隆抗体,为建立检测CIP残留的酶联免疫试剂盒和试纸条奠定了坚实的基础。

    摘要中的(目的)、(方法)、(结果)、(结论)这几个字一定要写,便于考察是否省略了书写要素,排版时会删除。作者必须使删除的文字流畅。)

    中国图书馆分类号(查询网站:S859.84文献识别码:a论文编号:2010-0337)

    (泰晤士新罗马5号,用分号隔开,小写首字母,特殊名词除外)

    正文不分栏,副标题及其内容均为《宋体五号》,单行间距,标准字间距。英语和数字在泰晤士新罗马;5号;可变符号要斜体,大小写和文字要一致;图表内容只需要中文,图表采用嵌入式格式。

    文中物种的学名:菌株的属名和种名(包括亚种和变种)用拉丁文斜体。属的首字母大写,其余小写,以上属为拉丁正字法。病毒总是正字法,第一个字母大写。

    限制性内切酶:前三个字母斜体,后面的字母与编码正字体对齐,如BamHI、EcoRI、MspI、Sau3AI等。

    氨基酸和碱基的缩写:氨基酸缩写用三个字母表示时,只有第一个字母大写,其余为小写和正字法。基本缩写是大写正字法。基因符号为小写斜体,蛋白质符号为大写正字法。)

    【研究意义】环丙沙星(CIP),又名普氟沙星、西福辛、环丙沙星、西福环、石普林等。CIP是合成的第三代喹诺酮类抗菌药物,具有广谱抗菌活性,杀菌效果好。其对几乎所有细菌的抗菌活性是诺氟沙星和依诺沙星的2~4倍,对肠杆菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、链球菌、军团菌和金黄色葡萄球菌均有抗菌作用[1](参考文献按正文中第一次引用的顺序连续编码,序号置于方括号内,标准格式以上。CIP主要用于临床治疗敏感菌引起的呼吸道、泌尿道、消化道、皮肤及软组织感染、胆囊炎、胆管炎等。由于其优异的抗菌性能,在畜牧业生产中被广泛用作药物饲料添加剂。【以往研究进展】但CIP进入畜禽后,淘汰缓慢【2】,CIP带来的残留问题日益受到各国政府的关注。目前检测CIP残留的方法多为高效液相色谱(HPLC)[3-5]、液相色谱-质谱(HPLC-MS)[6-7]、薄层色谱(TLC)[8]等物理化学方法。理化检测方法存在仪器昂贵、样品预处理复杂、繁琐耗时、无法现场操作等缺点,限制了其应用。【研究突破点】免疫学分析方法具有灵敏、快速、特异、简便等优点,近年来在兽药和农药残留检测领域得到广泛应用【9-11】,代表了现场筛选方法的研究发展方向。【需要解决的关键问题】本研究旨在用CIP人工抗原免疫BALB/c小鼠,建立分泌抗CIP单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞系,为建立免疫学检测方法和开发具有自主知识产权的检测产品奠定基础。((本研究的意义)、(以往的研究进展)、(本研究的突破点)、和(需要解决的关键问题)必须包括在内)

    盐酸环丙沙星,购自西格玛公司,纯度

    98%;BSA和OVA是从皮尔斯公司购买的。佐剂FCA和FIA,细胞培养基RPMI-1640,选择培养基HAT,HT,PEG-1500和Gibco产品;3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB),西格玛产品;新生牛血清,杭州四季青生物工程材料有限公司产品;华美生物工程有限公司的产品——IgG-辣根过氧化物酶;其他试剂是市售的,都是AR级的。农业部动物免疫学开放重点实验室培育并自养6周龄SPF BALB/c小鼠,小鼠骨髓瘤细胞系NS0由英国国家动物卫生研究所捐赠。实验于2008年12月至2009年5月在农业部动物免疫学重点开放实验室进行。(研究论文必须有具体的考试时间和地点)

    550型酶标仪,美国Bio-Rad公司生产;DU-600核酸蛋白质分析仪,德国贝克曼公司生产;德国西格玛公司生产的3K-18高速冷冻离心机;凝胶成像系统和分析软件,由Syngene公司生产;德国梅特勒生产的AE260电子天平;HI9321酸度计,美国汉纳公司生产;JM-250电泳仪,大连捷迈科贸公司生产;上海亚荣生化仪器厂生产的SZ-93自动双纯水蒸馏器,93-3定时恒温双向磁力搅拌器。

    1.3.1人工抗原的合成BSA-CIP完全抗原由碳二亚胺合成(EDC)。称取10毫克环丙肽和15毫克牛血清白蛋白,分别溶于1毫升PBS中,混合均匀,搅拌下溶解1小时,即为溶液a.取30毫克EDC,溶于1毫升PBS,即为溶液b,将溶液b滴加到溶液a中,室温下搅拌反应24小时。将反应产物放入透析袋中,在PBS中透析3天,每8小时更换一次溶液。透析后,产品分别储存在-20以备后用。用同样的方法制备包被抗原OVA-CIP。

    (1)用PBS配制CIP和BSA标准溶液进行紫外鉴别,在PBS中溶解一定量的BSA-CIP,用布拉福德法测定其蛋白质浓度,根据该浓度调节BSA-CIP溶液中BSA的浓度与BSA标准溶液一致,在200~400 nm波长范围内进行紫外扫描,根据吸收峰判断偶联情况。

    (2)按照郭[12]的方法,进行SDS-PAGE鉴定。浓缩凝胶为5%(W/V),分离凝胶为10%(W/V),浓缩电压为80 V,分离电压为40 V,进样量为10 L,考马斯亮蓝染色5~6 h后,在脱色液中脱色过夜。

    1.4.1小鼠免疫无菌PBS稀释BSA-CIP免疫原至500 g/mL(数字与单位之间有空格,对应单位采用斜线格式。3只6周龄雌性BALB/c小鼠经充分乳化后,用0.2毫升/只免疫,背部4~6点皮下注射。第一次免疫后2周进行强化免疫。将溶解在PBS中的BSA-CIP与等量的FIA混合,免疫4次,每次间隔2周。最后一次免疫后,在第8-12天切断尾巴并收集血液和分离血清。间接酶联免疫吸附试验用于检测抗环丙肽抗体的滴度,如果滴度

    1.010-3可用于细胞融合。最后一次强化免疫后4周,细胞融合前4天,用无菌PBS溶解牛血清白蛋白-环磷酸鸟苷,以0.2毫升的体积腹腔注射牛血清白蛋白-环磷酸鸟苷。

    1.5.1融合小鼠选择间接阻断ELISA检测多种抗血清的抑制值,选择抑制效果最好的小鼠作为融合小鼠,其他作为备用小鼠。

    1.5.2细胞融合将NS0骨髓瘤细胞在1640完全培养基中培养,并在融合前2天传代培养。融合前一天准备小鼠饲养细胞;超免疫后第4天,摘除眼球,从眶下窦采血,分离阳性血清,无菌取去颈后死亡小鼠脾脏制备脾细胞,在50%聚乙二醇-1500作用下与NS0细胞融合。将融合的细胞悬浮液加入铺有饲养细胞层的96孔细胞培养板中,然后放入37的5% CO2培养箱中。

    1.5.3融合细胞的培养、阳性杂交瘤的筛选和融合细胞的克隆。第10天,用高温培养基更换一半融合细胞。用间接ELISA和封闭ELISA筛选阳性孔,选择阳性强、抑制率高、细胞生长旺盛的孔进行有限稀释克隆,然后进行扩大培养、冷冻保存、菌种鉴定和建立。

    1.5.4单克隆抗体的产生单克隆抗体是通过在体内诱导腹水产生的[14]。扩大已建立细胞的培养,直至细胞数达到1106个/毫升,收集并测定ELISA滴度;BALB/c小鼠腹腔注射无菌液体石蜡0.5毫升/只,10天后注射克隆阳性细胞(3 ~ 6)106/只。约15天后提取腹水,用饱和硫酸铵盐析纯化单克隆抗体。

    1.6.2敏感性鉴定用封闭酶联免疫吸附法测定不同浓度的单克隆抗体对CIP的抑制率。以吸光度B/B0(B为不同浓度CIP的OD450值,B0为CIP0标准浓度的OD450值)为纵坐标,以不同浓度CIP的对数值为横坐标。绘制标准抑制曲线,进行相关回归分析,计算单克隆抗体对环磷腺苷的IC50。

    1.6.3使用CIP及其同源喹诺酮类药物作为抑制剂进行特异性鉴定,通过封闭ELISA测定各抑制剂的IC50,交叉反应率(Cr%)以单克隆抗体与CIP的IC50与各抑制剂的IC50之比的百分比确定[15]。

    1.6.4同种型和亚类的鉴定采用间接酶联免疫吸附试验

    (扫描图确保数值清晰可读。图中坐标轴标题不能省略,格式参考“叶绿素含量/(mg/g)”或“相对电导率/%”等。)

    间接ELISA效价见表1,IC50结果见图3。从表1可以看出,三只免疫小鼠的血清抗体滴度均达到10-4,达到了较好的免疫效果,第二只小鼠的血清滴度最高,IC50最低,选择其进行细胞融合。

    (Tahoma号,网格表,三线表(表线要行列分开)。原则上,表的内容中不应有空格。表中空白表示该项未测或未测,“或”表示未找到,“0”表示测得结果为零)

    图3 1号小鼠血清(pAb)通过阻断ELISA抑制CIP。数据图用excel软件制作,随数据库一起带来(带数据库的方法:先在Excel中生成图,复制,然后打开Word文本,在“编辑”下拉菜单中选择“特殊粘贴”,点击微软Excel图表对象)。

    检查是否带数据库:打开Word正文,双击图,带Excel数据)

    2.3杂交瘤细胞系的建立在细胞融合后第10天观察融合效果。4块细胞培养板形成286个杂交瘤克隆,融合率为74.5%。间接酶联免疫吸附试验显示有19个强阳性孔,强阳性率为6.6%。三次亚克隆后获得两个杂交瘤,并分别测定了它们的IC

    2.4单克隆抗体免疫学特性鉴定结果2.4.1效价测定结果从表2可以看出,杂交瘤分泌的抗CIP单克隆抗体效价较高,两种杂交瘤Z3G12B3和Z2H8C10的效价相近,细胞培养上清和腹水的效价分别达到13305.12 102。

    2.4.3交叉反应试验结果交叉反应试验结果见表3。表3显示了在建工程的IC50

    它是全文的结论和实验、观察结果和理论分析的逻辑发展。它可以是对中心思想的重申和对要点的概括,可以是启发性的解释,也可以是基于研究结果的预测。它应该被分成独立的段落,简明扼要。这项研究的主要结果被清楚地总结为供他人引用的基本结论。

    1.本研究的结果解释了哪些问题,得出了哪些规律性的东西,解决了哪些理论或实践问题;

    2.对以前关于这个问题的观点做过哪些检验,哪些与本研究结果一致,哪些不一致,作者做过哪些修改、补充、发展或否定;

    常见问题:结论被混淆为结果,结论被结果替代,结论与结果无法区分或区分。

    讨论环丙沙星是一种小分子药物抗原,本身无免疫原性。需要与载体蛋白偶联形成具有免疫原性的人工免疫原。根据CIP的化学结构,戊二醛法和EDC法可用于制备CIP人工抗原。研究组采用EDC方法对CIP-BSA进行耦合。由于EDC法是零长度桥,因此有效避免了桥抗体的出现,保证了抗体产生的特异性。动物体内诱导是目前一种经济、有效、应用广泛的方法。在动物的选择上,研究组选择了产后雌性BALB/c小鼠。在接种杂交瘤细胞前约10天,给小鼠注射液体石蜡、去甲植烷或弗氏不完全佐剂。原理是液体石蜡等腹水刺激物能有效抑制小鼠体内巨噬细胞和淋巴细胞的免疫功能,使小鼠更好地接受腹腔内具有恶性生长特征的杂交瘤。农业部动物免疫学重点开放实验室用无菌液体石蜡预处理小鼠,6天后注射杂交瘤,12天后收集腹水,取得了良好的效果。本研究利用杂交瘤技术成功获得了两株具有高亲和力和特异性的杂交瘤细胞。杂交瘤经多次传代、冷冻保存和复苏后,分泌出稳定的抗体,并制备出高滴度、高灵敏度、高特异性的抗CIP单克隆抗体。CIP单克隆抗体的成功制备为CIP残留免疫学检测方法的建立奠定了坚实的基础。

    请严格按照模板格式书写,特别注意

    例:[1]赞林森,郑,马,等.牛肉安全生产追溯信息系统的研究与应用[J].中国农业科学通报,2006,22(8):22-25。

    [序号]作者、书名、译者、版本(第一版未写)、出版地点:出版单位(国外出版单位可以使用标准缩写,不使用简称)、出版年份:页码。

    【序号】作者。标题。见(英文):主编。论文标题。出版地点:出版商,出版年份:页码。

    [序号]作者。题目:[学位论文]。地点:单位:年:

    例:[4]李。高速犁面:的优化设计[D]。北京:北京农业工程大学,1998336027-33。

    【序号】主要负责人。电子文件的标题[电子文件和承运人类型的识别]。电子文档的来源或可用地址、出版或更新日期/引用日期(可选)。

    判例:[5]王明亮。不同品系稻象甲和赤拟谷盗成虫磷化氢击倒时间与抗性的关系。

    【序号】起草负责人。标准代码、标准序号、发布年份、标准名称、出版地点的出版商、出版年份:引文的起止页码。

    例:[7]农业部农机鉴定站、广西农机鉴定站、湖南农机鉴定站等。GB566785,《农业机械生产试验方法》。北京:中国标准出版社,1986336032。

    【序号】作者。标题。见(英文):原文件负责人。标题。版本。出版地点:出版商,出版年份。原始文档中的起始页码。

    例:[9]黄云辉。国际矿物学研究趋势。参见程主编的:世界地质科学与技术趋势[M]。北京:地质出版社,1982:39-39。


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