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    微生物发酵合成血红蛋白的研究进展

    发布日期:2021-02-21 09:51 生物论文

    最近,《生物技术趋势》发表了江南大学未来食品科学中心和生物工程学院陈建院士团队的总结。副研究员赵心瑞为第一作者,周静雯教授为通讯作者,论文作者还包括陈建教授和杜国成教授。

    血红蛋白是一种含铁的金属蛋白,存在于原核和真核细胞中,具有运输和储存氧气、调节细胞内pH值、调节生理代谢等多种重要功能。近年来,血红蛋白已被用于急救医学(作为无细胞氧载体)、医疗保健(作为补铁剂)、食品加工(食品级着色和调味剂)等领域。但血红蛋白仍然需要从血液或植物组织中提取,不仅耗时低效,而且使用化学试剂容易造成环境污染。因此,基于微生物细胞工厂从不同来源合成血红蛋白已成为近年来的研究热点。

    NCBI基因库数据库中有超过141,110个血红蛋白基因编码序列,EMBL蛋白质数据库中有超过84,424个血红蛋白氨基酸序列,PDB蛋白质晶体数据库中有725个血红蛋白三维结构数据。但目前只有15种不同来源的血红蛋白(人、大豆、鳄鱼等)。)可以由9种有限的微生物(大肠杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌等)组成。根据现有血红蛋白氨基酸序列的进化树分析,发现不同来源的血红蛋白及其亚基可分为几种:动物来源的血红蛋白亚基、亚基及其他类型的亚基、植物来源的单亚基血红蛋白和微生物来源的血红蛋白(图1)。因此,可以综合应用越来越成熟的代谢工程和合成生物学策略,开发出一种有效稳定的血红蛋白微生物合成方法,以满足人类、大豆、透明颤菌等不同物种血红蛋白的大规模应用需求。

    血红素是血红蛋白履行其生理功能所必需的辅助基团。为了高效合成血红蛋白,需要增加细胞内血红蛋白的供应水平。在自然界中,血红素的合成主要通过C4和C5途径(图2),细胞内血红素前体5-氨基乙酰丙酸(ALA)的含量可以通过加强C4途径和补充甘氨酸和琥珀酸作为底物或加强C5途径对抗反馈抑制来增加。在此基础上,血红素合成的下游途径不断加强和模块化,在大肠杆菌中无需添加底物即可实现115.52.3mg/L的血红素合成。此外,由于细胞中血红素含量高,可以显著抑制细菌的生长,因此利用血红素转运蛋白可以分泌合成60%以上的血红素,降低血红素对细胞的毒性作用。

    在提高血红蛋白供给水平的基础上,利用大肠杆菌、酵母等微生物宿主成功合成了不同来源的血红蛋白。目前,由于代谢成熟,培养成本低,70%以上的血红蛋白是由大肠杆菌合成的。首先,为了提高血红蛋白在大肠杆菌中的溶解度,密码子优化、启动子和载体的适应性组合、蛋白质增溶标记被成功应用以避免包涵体的形成;其次,为了增强动物源性血红蛋白亚基的表达,亚基编码基因的串联表达和稳定辅因子AHSP的共表达也被用来提高亚基的稳定类型。此外,由于血红素在大肠杆菌宿主体内合成和转运能力较弱,通过引入志贺氏假单胞菌的血红素转运系统,并在细胞外添加高浓度的血红素,可以提高细胞内的血红素水平(图3)。在初步获得血红蛋白的基础上,我们可以通过结合人血红蛋白亚基和牛血红蛋白亚基,进一步开发一种自聚合的人牛血红蛋白(180-500kDa聚合物),延长市售无细胞氧载体产品在血液中的半衰期;在宿主体内共表达甲硫氨酸氨基肽酶,以加速血红蛋白n端甲硫氨酸残基的正确去除;优化诱导剂浓度、诱导温度等发酵条件,提高血红蛋白产量。

    除大肠杆菌外,酿酒酵母、毕赤酵母等酵母菌株也是血红蛋白合成的高效平台。然而,在以前的研究中,由酿酒酵母合成的血红蛋白的产率较低。近年来,通过优化血红蛋白与亚基表达水平的比值,强化血红素合成途径,敲除转录因子Hap1p转化氧传感途径(图3),人类血红蛋白最高含量可达细胞内可溶性总蛋白的7%。毕赤酵母是生产商品大豆血红蛋白的高效宿主,获得的大豆血红蛋白可以添加到新的人工肉制品中,模拟真实肉类的颜色和风味。由不可能食品公司开发的可商业化合成大豆血红蛋白的毕赤酵母菌株已获得FDA许可,并在多个国家申请专利。该菌株血红素合成所需的8种酶分为3个模块,由甲醇诱导的AOX1启动子增强。此外,大豆血红蛋白基因和转录激活因子Mxr1p的两个拷贝也被整合到基因组中。最后,通过优化高密度发酵条件,实现了大豆血红蛋白的大规模工业化生产(图3)。

    目前,虽然微生物合成血红蛋白已经成功,但大多数血红蛋白的产量仍然很低,这对重组血红蛋白在生产中的应用提出了很大的挑战。在未来的研究中,可以采用新的策略来加强菌株的合成能力(图4):首先,通过深度学习可以发现具有特殊功能或特性的未知血红蛋白基因,如高温不易变色的三叶草血红蛋白;其次,要继续寻找血红素合成途径中的限速步骤,利用蛋白质支架等策略去除这些步骤之间的空间隔离;第三,抑制细胞内血红素合成途径和血红素加氧酶中血红素副产物的降解;最后,由于血红素对细胞有毒性,血红素合成途径中酶的过量表达会增加宿主的代谢负担,因此利用血红素传感器实现血红素合成和血红蛋白表达之间的代谢平衡是突破血红蛋白合成瓶颈的关键。

    本综述得到了国家重点R&D项目(2019YFA0906400)、国家自然科学基金(31900067)和“轻工业技术与工程1”国家一级学科项目(LITE2018-08)的资助。它发表在《生物技术趋势》杂志上(生物技术趋势,2021,39 (3),286-297,)。


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