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    从Crisp基因编辑技术看SARS-CoV-2生物学

    发布日期:2021-01-15 13:13 生物论文

    2020年1月31日,细胞出版社新型冠状病毒资源中心正式开业。你可以在Cell Press的期刊上找到新冠肺炎相关论文的投稿政策,以及关于疫情和病毒的论文。网站在不断更新,所有内容都可以免费阅读。

    发表在细胞出版社细胞出版社《细胞》杂志上的最新综述,题为《一个Crisp(R)SARS-CoV-2生物学的新视角》,来自华盛顿大学的研究人员让我们从基因编辑的角度充分了解了这种新病毒家族的细胞生命周期,这对医学的发展至关重要。

    由几个研究小组进行的全基因组CRISPR-Cas9筛选是相互补充的,揭示了对SARS-CoV-2生物学的新见解,包括病毒的进入、翻译、复制、排出和调节这些过程的基因。通过将新的冠状病毒与其他冠状病毒进行比较,我们可以充分了解这种新病毒家族的细胞生命周期,这对医学的发展非常重要。

    近五年来,基于CRISPR的筛选在细胞生物学领域掀起了一股引人注目的发现浪潮,病毒与宿主的相互作用当然也是研究热点之一(Puschnik等人,2017)。许多研究小组已经开发了许多由小导向(sg)RNA库转导的细胞系,它们可以在每个细胞中插入或删除单个基因,从而使相应蛋白质的表达或功能失效。经过几周的溶细胞病毒存活筛选,可以获得抗感染和死亡细胞。虽然这种方法不能鉴定细胞存活所必需的病毒促进因子,但它仍然是一种可靠的方法,通过对活细胞中基因特异性sgRNA的测序,可以发现病毒感染所需的许多宿主因子。在这一期的细胞,三个新的文章(霍夫曼等人,2020年;Schneider等人,2020年;王等,2020)丰富了SARS-CoV-2感染所需的宿主蛋白列表。为了鉴定这些蛋白质,这些研究使用了基于CRISPR的活细胞筛选(Daniloski等人,2020;魏等,2020).五个研究小组使用了几种不同的sgRNA文库(Brunello、GeCKOv2和GeckoV 2),以及几种来源于肺、肝、肾和骨髓细胞的人细胞系或猴细胞系(在某些情况下,还辅之以SARS-CoV-2受体——人ACE2的外源表达),发现了大量关于SARS-CoV-2生物学的信息,这将为该领域今后的研究奠定基础。

    这些筛选相互验证了彼此的发现。主要方法是鉴定同一基因或编码一组蛋白质的一组基因,它们可以在细胞中形成相互独立的功能复合物或细胞途径。虽然我们不知道这些蛋白质在病毒生命周期中的确切作用,但它们的亚细胞定位可能为SARS-CoV-2的生物学提供见解(图1)。

    这些筛选发现了许多位于内质网(ER)、ER-高尔基中间区(very)和高尔基体中的蛋白质,这些蛋白质对病毒诱导的感染和细胞死亡非常重要,反映了这些细胞结构在SARS-CoV-2结构蛋白翻译和病毒体组装中的作用。相对模糊的蛋白TMEM41B是SARS-CoV-2感染的重要ER宿主因子之一。霍夫曼和他的团队还发现,这种蛋白质是黄病毒科病毒的重要宿主因子(霍夫曼等人,2020年c)。

    最后,这些研究还确定了病毒生命周期“输出”阶段的其他几个重要宿主因素。虽然尚不清楚,但最近的研究发现,溶酶体胞吐是冠状病毒排出感染细胞的途径之一(Ghosh等人,2020)。鉴于此,这些筛选中许多看似无关的物质,如细胞外复合物、磷脂酰肌醇激酶(PIK3C3、PICfyve)和其他与内体再循环有关的物质(Compor复合物、逆转录酶复合物、TMEM106B)——实际上可能在病毒颗粒通过溶酶体胞吐和/或其他细胞外途径进入和/或离开细胞中起作用。

    这些论文中发现的基因需要进一步研究,才能全面了解SARS-CoV-2的生命周期。因此,有必要探索与病毒蛋白直接相互作用的因子(如王等人[2020]提出的SCAP),并将其与调节病毒蛋白与其他宿主蛋白相互作用的因子(如魏等人[2020]提出的SWI/SNF)区分开来。在细胞系模型中利用CRISPR技术筛选活细胞是一个开端,因为探索这些蛋白与人类原代细胞中SARS-CoV-2生物学的相关性非常重要,有利于揭示SARS-CoV-2在人体内的特定生理过程。例如,一项新的研究表明,在人体内循环的SARS-CoV-2优先以TMPRSS2介导的尖峰激活(Hoffmann等人,2020a)和细胞膜融合为进入人肺上皮细胞的主要途径。然而,当SARS-CoV-2在TMPRSS2表达水平低的细胞系(如Vero细胞)中传递时,通常选择在弗林酶切割位点突变的突变体,并通过内吞作用进入细胞。上述两种不同的细胞进入途径并不相互排斥,在体内和体外由于细胞类型不同而可能不同(Hoffmann等,2020bSimmons等人,2013年).然而,对于用低水平表达TMPRSS2的细胞系进行筛选,我们需要仔细解释结果,即内体宿主因子不一定是病毒促进的,直到我们在原代细胞中得到验证。

    筛选中发现的许多基因产物和复合物可能是针对新冠肺炎的治疗靶点。事实上,一些研究提供的数据显示了一些化合物在靶向筛选中的抗病毒活性(Daniloski等人,2020;王等,2020).虽然基因筛查提示有必要进一步探索与这些病毒宿主因子结合的现有复合物和药物,但我们也需要利用生化筛查来寻找靶向这些途径的小分子,这可能会揭示抗SARS-CoV-2感染的新抗病毒药物。最后,许多研究报告称,除了SARS-CoV-2,一些基因也能有效对抗许多不同的冠状病毒(有时包括来自其他家族的病毒)。这种方法可以确认病毒生物学的共性,进而开发出功能广泛的抗病毒药物,有助于我们为下一轮病毒大流行做好准备。图1。基于CRISPR-Cas9技术的活细胞筛选鉴定强毒宿主因子

    该图显示了病毒蛋白质(或多因子复合物)(红色)及其假定的亚细胞定位(黑色),以及这些蛋白质(或复合物)在病毒生命周期中的假定作用(紫色)。SARS-CoV-2与细胞表面受体结合后,通过两种可能的机制进入细胞——进行病毒颗粒膜和质膜的内吞或融合。在细胞质中,RNA基因组被翻译和复制,产生亚基因组转录RNA。结构基因的翻译发生在粗面内质网(ER)中,而病毒体的组装、成熟和转录后修饰发生在整个ER、ER-高尔基中间区(energy)和高尔基网络中,但具体过程尚不清楚。病毒颗粒通过溶酶体和/或其他胞吐小泡运输到细胞表面。内体循环和内体与溶酶体的相互作用被认为在病毒排泄中起重要作用,但目前尚不清楚。相关论文信息


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